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原位杂交/探针定制服务

ISH探针定制服务

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TZDZ

3000元/100T

ISH

专项定制服务

3-4周

选择规格:

总价格:

---元*1

选择数量:

- +

Product Brief

  • 服务内容:
    ◆  没有现货的原位杂交试剂盒(探针)定做,一般需3-4周左右的时间;
    ◆  定制的探针为3’尾端地高辛高效标记的寡核苷酸探针,用于检测目的基因mRNA(信使RNA);
    ◆  定制试剂盒为100T,每盒约可以满足100张切片的需要;常规哺乳动物价格为3000元/盒(POD/AP/FITC/CY3系统);非哺乳类价格为3800元/盒(POD/AP/FITC/CY3系统)。
         其中POD系统(过氧化物酶系统)形成的阳性复合物较稳定,为最常用的显色系统。
    ◆  正式定货时,用户需交纳定金:500元/盒(注明所订试剂盒的中英文名称、实验动物种类及所用标本)。余款在试剂盒生产完成和检验后付清。

    如果您有定制原位杂交试剂盒的意向,请您下载以下原位杂交定制咨询卡,填写后将其发送至我们的邮箱boster@188.com,以便我们更好地为您确定是否可以正常定做。

    原位杂交定制咨询卡下载



Instructions

试剂盒的使用同原位杂交试剂盒使用方法,原位杂交试剂盒使用实例:BCL-2 原位杂交检测试剂盒

产品货号:MK1050

保存条件:置4℃。

工作量:100张切片。

有效期:一年。

       BCL-2 是主要的抗凋亡基因。本试剂盒采用针对人、大鼠、小鼠的BCL-2 特异性的寡核苷酸探针,经地高辛标记。由于采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术,并配合使用敏感性加强型的原位检测方法,具有敏感性特别高,背景清晰,结果准确可靠的优点。可以检测出常规福尔马林固定,石蜡包埋标本的BCL-2 mRNA 序列。针对大鼠、小鼠BCL-2 靶基因的mRNA 序列为:

(1) 5’——GATGA AGTAC ATCCA TTATA AGCTG TCACA——3’;

(2) 5’——GCGCT CAGCC CTGTG CCACC TGTGG TCCAC——3’;

(3) 5’——GGGAG ATGTC ACCCC TGGTG GACAA CATCG——3’;

大鼠、小鼠和人的序列仅3bp/90bp 不同,兔和人序列基本相同。

适用种属:人、大鼠、兔、小鼠组织。

试剂盒中内容

1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml;

2. 预杂交液2ml;

3. Bcl-2寡核苷酸探针杂交液2ml;

4.封闭液5ml;

5.生物素化鼠抗地高辛5ml;

6. SABC-POD 5ml;

7. 生物素化过氧化物酶5ml。

用户自备试剂:原位杂交专用盖玻片(博士德有售);POLY-L-LYSINE;DEPC;20%甘油

缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC,0.5×SSC,0.2×SSC, 原位杂交用PBS )

一.培养细胞和冰冻切片

准备工作:

固定液:4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6);1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,PH2.0左右。2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠17.6g,柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O,分子量294)8.8g。0.5×SSC——300ml 蒸馏水加100ml 2×SSC 即可。0.2×SSC——270ml 蒸馏水加30ml 2×SSC 即可。20%甘油——20ml 甘油加80ml 蒸馏水即可。原位杂交用PBS——0.02M phosphate ;0.5M NaCl(1000ml 蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4·12H2O6g, NaH2PO4·2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。

操作程序: 注意:最重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC 处理,以抑制RNA 酶对mRNA 的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为

Dulbecco 基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2 分钟×3 次。

3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定20--30 分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2 周以

上。

4.30%H2O2 1 份+纯甲醇50 份混合,室温处理30 分钟。蒸馏水洗涤3 次。

5.暴露mRNA 核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2 滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120 秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS 洗3 次×5 分钟。蒸馏水洗1 次。

6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEPC。室温固定10 分钟。蒸馏水洗涤3 次。

7. 预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml 以保持湿度。按每张切片20μι

加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4 小时。吸取多余液体,不洗。

8. 杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,

盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。

9. 杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC 洗涤5 分钟×2 次;37℃0.5×SSC 洗涤15 分钟×1 次; 37℃0.2×SSC 洗涤15 分钟×1 次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC 洗涤15 分钟×1-2 次)。

10.滴加封闭液:37℃30 分钟。甩去多余液体,不洗

11.滴加生物素化鼠抗地高辛:37℃ 60 分钟或室温120 分钟。原位杂交用PBS 洗5 分钟×4 次。

勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

12.滴加SABC:37℃20 分钟或室温30 分钟。原位杂交用PBS 洗5 分钟×3 次。勿用其它缓冲液

和蒸馏水洗涤。

13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20 分钟或室温30 分钟。原位杂交用PBS 洗5 分钟×4 次。

14.DAB 显色:使用DAB 显色试剂盒—1ml 蒸馏水加显色剂A,B,C 各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30 分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB 显色剂后显色。充分水洗。

15.必要时苏木素复染,充分水洗。

16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。

二.石蜡切片

如果有条件的话,应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后,及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6),含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm 的小块,固定1 小时即可,较大的标本固定不要超过2 小时。某些组织对过度固定尤其敏感,如动物大脑,固定时间30-40 分钟,一般不要超过1 小时。

1. 常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。

2. 玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。

3. 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1 份+蒸馏水10 份混合,室温5-10 分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3 次。

4.暴露mRNA 核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2 滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化3--30 分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间,例如5 分钟,10 分钟,20 分钟,30 分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS 洗3 次×5 分钟。蒸馏水洗1 次。其余步骤和冰冻切片6-16 步相同。

结果观察:bcl-2 mRNA 的细胞胞浆着色呈棕黄色。

注意事项:由于特定的mRNA 序列仅占总mRNA 的极少数,加上基因仅由四个碱基排列组合而成,因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照,基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时,用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释,一般稀释2—10 倍;并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况;如果出现大量的细胞核着色,往往和标本固定时间过长有关,应重新处理标本。


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