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RIPA裂解液(中)

蛋白抽提试剂,AR0105-10,AR0105-30,AR0105-100

分类:

免疫印迹检测系统 - 蛋白抽提

说明书:

AR0105.jpg
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AR0105

38元/10ml  88元/30ml  198元/100ml  

WB

WB辅助试剂

现货

总价格:

---元*1

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- +

Product Brief

  • 产品概况

    产品货号AR0105
    产品名称RIPA裂解液(中)
    价格规格¥38/10ml;¥88/30ml;¥198/100ml
    产品描述对于5×10^6 个细胞的抽提样品,本品可以抽提200次,对于0.1g的组织抽提样品,本品可以抽提100次,本产品可在60分钟的时间内完成蛋白的提取。
    产品说明博士德RIPA裂解液是最可靠的缓冲液之一,其主要成分含1% NP-40, 0.5% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS,该缓冲液能够从细胞质,膜和核蛋白质中提取蛋白质,并且与许 多应用相容,包括报道分析,蛋白质分析,免疫分析和蛋白质纯化。RIPA缓冲液不含蛋白 酶或磷酸酶抑制剂,如果需要,可将酶抑制剂添加到试剂中以防止蛋白质水解并维持蛋白质 的磷酸化状态。一些蛋白激酶和其他酶可能对RIPA缓冲液的组分敏感,导致其活性降低。 在这种情况下,准备不含脱氧胆酸钠和SDS的RIPA缓冲液。
    材料需要

    蛋白酶和磷酸酶抑制剂

    2ml离心管

    组织研磨器

    能达到10000g的离心机

    细胞刮

    注意事项

    1.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

    2.裂解得到的蛋白样品,含有较高浓度的去垢剂,不建议用Bradford 法测定蛋白浓度,可以选用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。 

    3.裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,例如NFKB、p53等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子。


Instructions

使用方法:

对于细胞:

注意:取适当量的裂解液,放与4℃预冷,使用前数分钟内需加入酶抑制剂。

1.  贴壁细胞,细胞刮刮下细胞,计数,并收集5×106 个细胞,600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,用预冷的PBS重悬细胞,600g 离心5分钟收集细胞,尽量吸尽上清,加入0.5ml的预冷的裂解液,用移液器吹打数下,冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。

注意:可以直接将裂解液加入培养细胞的器皿中裂解细胞,具体操作如下,

A.用移液枪小心吸去培养液,

B.加入适量的预冷的PBS,

C.用移液枪小心吸去PBS,

D.按照下表加入裂解液,4℃孵育30分钟。

E.将裂解液转入离心管中, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。

 

板规格/表面积

试剂用量

100mm                      

500~1000ul

60mm

250~500ul

6-well   plate

200~400ul   per well

24-well   plate

100~200ul   per well

96-well   plate 

50~100ul   per well

 


2.悬浮细胞,计数,并收集5×106 个细胞,600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,用预冷的PBS重悬细胞,600g 离心5分钟收集细胞,尽量吸尽上清,加入0.5ml的预冷的裂解液,用移液器吹打数下,冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。

对于组织:

注意:取适当量的裂解液,放与4℃预冷,使用前数分钟内需加入酶抑制剂。

1. 手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中,漂洗数次,洗净组织血迹,用滤纸吸干组织表面液体,将组织切成几个较小的组织块。

2. 称量组织,按组织净重(g):裂解液(ml)=1:10的比例,加入相应体积的裂解液进行匀浆 ,(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量)。

3. 匀浆器匀浆,肉眼观察无明显组织块,冰上孵育30分钟。

4. 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。

 

结果实例:    

         M    N                       M    N                  M     N     

1-1.png   2.png   3.png

          DSG3                       HSP90                   PCNA

M:Hela Cells  N:A549 Cells

如图:RIPA裂解提取细胞蛋白,BCA测定蛋白浓度,上样20ug,电泳,转膜,孵育博士德一抗,应用博士德ECL发光液显色。

故障排除:

问题

原因

解决办法

总蛋白量低

有些细胞较难裂解

确保细胞沉淀完全悬浮在RIPA缓冲液中

并孵化更长的时间,超声波处理以增加产量

蛋白浓度低

裂解液用量多

减少裂解液的用量

蛋白水解

没有加入蛋白酶抑制剂

加入蛋白酶抑制剂

磷酸化蛋白量少

磷酸酶活性高

加入磷酸酶抑制剂

 


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