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亚细胞结构膜蛋白提取试剂盒

蛋白提取试剂盒

分类:

免疫印迹检测系统 - 蛋白抽提

说明书:

AR0155

600元/Kit

WB

WB辅助试剂

现货

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Product Brief

  • 产品概况

    产品货号AR0155
    产品名称亚细胞结构真核膜蛋白提取试剂盒
    产品价格¥600/kit
    产品规格蛋白抽提液A液 30ml
    蛋白抽提液B液 100ml
    产品保存4℃保存,一年有效
    产品说明该试剂盒提供优化的缓冲液和试剂,用来高效地抽提哺乳动物组织和细胞的膜蛋白。以温和的裂解液为基础富集膜蛋白。首先,细胞以温和裂解液裂解,再添加裂解液以溶解膜蛋白在37℃下孵育,通过水相和去污相分离,此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。试剂盒所抽提出的膜蛋白可用于免疫印迹,二维电泳和酶活性分析等多种检测方法。


Instructions

注意: 抽提蛋白前,将膜蛋白抽提试剂A.B置于冰浴上(抽提试剂B在室温会分层).提取试剂A.B在使用前数分钟内需加入酶抑制剂(博士德产品货号为AR1178,AR1182,AR1182)。
细胞:
1.对于贴壁细胞:去除培养液,用预冷的PBS 洗一遍,并用细胞刮刮下细胞(最好不用胰酶消化,可能降解蛋白)。3000g 离心5min收集细胞,尽量吸尽上清,留下细胞沉淀备用。
2.对于悬浮细胞:3000g 离心5min收集细胞,尽量吸尽上清,留下细胞沉淀备用。
3.用适量预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀,4℃,3000g离心5min沉淀细胞,弃上清。
4.加入预冷的蛋白抽提液A重悬细胞沉淀(约为细胞沉淀体积的5-10倍),在冰上孵育10-15min,期间取出震荡数次。
5.添加1-3倍体积的预冷的蛋白抽提液B液,冰上孵育1小时,期间取出震荡数次。
6.在4℃ 10000g离心10分钟,将上清转移至新的离心管中,弃沉淀,上清在37℃环境下孵育10min以分离膜蛋白,为了提高膜蛋白分离效率,可以适当延长孵育时间至20分钟。
7.37℃的环境下10000g离心10分钟(如分层不明显,可以加大离心力至12000g以及离心时间),以将含疏水膜蛋白的去污剂相从中分离出来,以最快的速度将上层的水相弃去(样品上下分层,下层含膜蛋白)。
8.为提高膜蛋白的纯度(此时膜蛋白得量也会相应降低),可将下层的含膜蛋白的去污相溶于预冷的PBS中,重复6.7步骤2-3次。
9.将分离的膜蛋白溶液冷冻分装保存,可以用于膜蛋白的分析。组织:
1.手术切除的组织块(组织块尽量不含脂肪组织和结缔组织等非目的组织)迅速置于预冷的PBS中,漂洗数次,将组织称量后切成几个较小的组织块放入组织匀浆器中,加入预冷的抽提液A(按照0.1g组织加入1ml抽提试剂A),至于冰上匀浆,匀浆后镜检,细胞破碎率不小于90%,同时没有明显的组织小块。
2.在冰上孵育10-15分钟,期间取出震荡数次。
3.添加1-3倍体积的预冷的蛋白抽提液B液,冰上孵育1小时,期间取出震荡数次。
4.在4℃下10000 g离心10分钟,将上清转移至新的离心管中,弃沉淀,上清在37℃的环境下孵育10分钟以分离膜蛋白,为了提高膜蛋白分离效率,可以适当延长孵育时间至20分钟。如离心分层不明显,可增加离心转速至12000g和离心时间。
5.37℃的环境下10000g离心10分钟(如分层不明显,可以加大离心力至12000g以及离心时间),以将含疏水膜蛋白的去污剂相从中分离出来,以最快的速度将上层的水相弃去(样品上下分层,下层含膜蛋白)。
6.为提高膜蛋白的纯度(此时膜蛋白得量也会相应降低),可将下层的含膜蛋白的去污相溶于预冷的PBS中,重复4.5步骤2-3次。
7.将分离的膜蛋白溶液冷冻分装保存,可以用于膜蛋白的分析。

【SDS-PAGE电泳操作步骤】
1.每100ul膜蛋白提取混合物加入0.9ml丙酮,冰浴20min,10000g离心20min。
2.弃上清,沉淀置冰上干燥10min(敞开离心管盖),加入适当体积的上样缓冲液溶解,沸水浴3-5min,如还有难溶物,可取上清上样电泳,也可以加入一定量的Urea,Thiourea,NDSB-20等试剂有助于膜蛋白完全溶解。

注意事项:
1.所有试剂需预冷后使用,以保证蛋白的完整性。
2.抽提试剂B在低温下为浑浊状态,请于此温度下混匀后吸取加入样本中。
3.如果需要,请在实验前,将酶抑制剂加入抽提试剂中。
4.对于提取的膜蛋白,建议使用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。


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