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亚细胞结构膜蛋白与胞浆蛋白抽提试剂盒(60次)

蛋白提取试剂盒

分类:

免疫印迹检测系统 - 蛋白抽提

说明书:

AR0155

600元/Kit  

WB

WB辅助试剂

现货

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Product Brief

  • 产品概况

    产品货号AR0155
    产品名称亚细胞结构膜蛋白与胞浆蛋白抽提试剂盒(60次)
    产品价格¥600/kit
    产品规格

    细胞破碎缓冲液   30ml            

    蛋白增溶缓冲液   100ml

    产品保存4℃保存,一年有效
    产品说明

    对于5×10^6 个细胞的抽提样品,本品可以抽提60次,对于50mg的组织抽提样品,本品可以抽提60次,本产品可在90分钟的时间内完成蛋白的提取。

    博士德的细胞膜蛋白提取试剂盒是一种简单,快速和可重复提取细胞膜蛋白的方法,用于制备高度富含膜蛋白和疏水蛋白的细胞蛋白组分,与用于分离膜蛋白的许多程序不同,该试剂盒不需要使用超速离心或密度梯度离心,该试剂盒降低样品复杂性,以提高低丰度蛋白质(如膜蛋白)的机会,分离的蛋白质与多种下游应用,如SDS-PAGE,免疫印记,BCA,免疫沉淀,酶活性分析等相容。本试剂盒是基于Triton X-114洗涤剂并通过温度依赖性相分配来分离膜蛋白。样品首先在细胞破碎缓冲液中混合并匀浆,在37℃短暂孵育后,将样品离心,产生上层亲水相和下层疏水相,锚定在膜上的蛋白质或含有一个或两个跨膜结构域的蛋白质被有效分配到疏水相,细胞质蛋白分配到亲水相中,膜蛋白通常以高达90%的效率提取,细胞质蛋白进入膜部分的交叉污染通常小于10%。


Instructions

注意事项:

1.为获得最佳效果,在破碎和增溶缓冲液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

2.所有试剂需预冷后使用,以保证蛋白的完整性。

3.蛋白增溶缓冲液在低温下为浑浊状态,请于此温度下混匀后吸取加入样本中。

4.对于提取的膜蛋白,建议使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量。

5.如果膜蛋白部分中的洗涤剂干扰下游应用,可以减少样品中的洗涤剂含量,去除量需要凭经验确定。

6.因为除去过多的洗涤剂可能导致蛋白质沉淀。

7.两部分都与SDS-PAGE相容。

8.本产品适用于哺乳动物细胞和组织。

需要材料:

蛋白酶和磷酸酶抑制剂

恒温水浴锅

2ml离心管

组织匀浆器

超声仪

涡旋混合器

细胞刮

能达到16000g的离心机

使用方法:

注意:抽提蛋白前,将细胞破碎缓冲液和蛋白增溶缓冲液置于冰上预冷,在使用前数分钟内加入酶抑制剂。

细胞:

1.对于贴壁细胞细胞刮刮下细胞,计数,并收集5×106 个细胞,600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,留下细胞沉淀备用。

2.对于悬浮细胞:计数,并收集5×106 个细胞,600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,留下细胞沉淀备。

3.用适量预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀,600g离心5分钟沉淀细胞,弃上清。

4.加入0.5ml的预冷的细胞破碎缓冲液,混匀,转入预冷的离心管,在冰上孵育15分钟,定期混合悬浮液30秒(3到4次)。

5.用超声波探头超声处理悬浮液,破碎细胞并碎片化基因组DNA。在超声处理过程中,必须小心操作以防止样品发热。超声破碎30-40秒,直到裂解完成(通常3-4次)。在每次超声处理之间,将悬浮液在冰上冷冻1分钟。

6.添加0.5ml预冷的蛋白增溶缓冲液,混匀,冰上孵育10分钟,定期混合悬浮液60秒(4到5次),在每个涡旋步骤之间将管保持在冰水浴中30-60秒。

7.将离心管转移到37℃水浴中孵育30分钟,定期混合悬浮液30秒(3到4次)。

8.在离心机中以16000g室温离心5分钟,仔细观察会有两相,将上层亲水相转移至一新的离心管中。

9.将0.5ml的蛋白增溶缓冲液加入到底部疏水相的管中,重复第6步到第8步。

10.合并两次收集的上层亲水相,此为胞浆蛋白,可以保存在-80℃以备日后使用。

11.收集底部疏水相并转移到新的离心管中,可以保存在-80℃以备日后使用。

12.底部碎片请将其取出,留待以后分析或丢弃。

注意:如果不能立即进行下游应用,亲水相和疏水相蛋白应快速冷冻,然后储存在-80℃。此外,为了避免样品反复冻融,可分装保存使用。

 

组织:

1.准备50mg的组织块,迅速置于预冷的PBS中,漂洗数次,将组织切成几个较小的组织块,放入组织匀浆器中。

2.加入预冷的细胞破碎缓冲液0.5ml,至于冰上匀浆,直至获得均匀的悬浮液,转入预冷的离心管。

3.在冰上孵育15分钟,定期混合悬浮液30秒(3到4次)。

4.用超声波探头超声处理悬浮液,破碎细胞并碎片化基因组DNA。在超声处理过程中,必须小心操作以防止样品发热。超声破碎30-40秒,直到裂解完成(通常3-4次)。在每次超声处理之间,将悬浮液在冰上冷冻1分钟。

5.添加0.5ml预冷的蛋白增溶缓冲液,混匀,冰上孵育10分钟,定期混合悬浮液60秒(4到5次),在每个涡旋步骤之间将管保持在冰水浴中30-60秒。

6.将离心管转移到37℃水浴中孵育30分钟,定期混合悬浮液30秒(3到4次)。

7.在离心机中以16000g室温离心5分钟,仔细观察会有两相,将上层亲水相转移至一新的离心管中。

8.将0.5ml蛋白增溶缓冲液加入到底部疏水相的管中,重复第6步到第8步。

9.合并两次收集的上层亲水相,此为胞浆蛋白,可以保存在-80℃以备日后使用。

10.收集底部疏水相并转移到新的离心管中,可以保存在-80℃以备日后使用。

11.底部碎片请将其取出,留待以后分析或丢弃。

注意:如果不能立即进行下游应用,亲水相和疏水相蛋白应快速冷冻,然后储存在-80℃。此外,为了避免样品反复冻融,可分装保存使用。

SDS-PAGE电泳操作步骤:

1.每100ul膜蛋白提取混合物加入0.9ml丙酮,冰浴20分钟,10000g离心20分钟。

2.弃上清,沉淀置冰上干燥10分钟(敞开离心管盖),加入适当体积的上样缓冲液溶解,沸水浴5分钟,如还有难溶物,可取上清上样电泳,也可以加入一定量的Urea,Thiourea,NDSB-20等试剂有助于膜蛋白完全溶解。

结果实例1:

8-8.png

依照本说明书操作,5×106 个不同的细胞得到的膜蛋白的量,使用博士德的BCA蛋白浓度测定试剂盒测浓度得到

的蛋白量。

结果实例2:

9-9.jpg

应用本试剂盒从冷冻的小鼠肺和心肌提取膜蛋白,通过SDS-PAGE分离膜蛋白和胞质蛋白,上样10ug,并转移到NC膜上,孵育一抗,使用博士德发光底物生成图像。

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AR1182        广谱蛋白酶抑制剂

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AR0146        BCA蛋白浓度测定试剂盒

AR0131        SDS-PAGE蛋白上样缓冲液2X(变性)

故障排除:

问题

问题原因

解决方法

膜蛋白与浆蛋白交叉污染

没有完全去除细胞上清

确保完全去除细胞质提取物

细胞破碎不完全

增加细胞破碎时间

膜蛋白产量低

膜蛋白分离不完全

增加孵育时间

细胞和组织量不够

增加细胞和组织的量


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