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亚细胞结构胞核与胞浆蛋白抽提试剂盒(60次)

蛋白提取试剂盒

分类:

免疫印迹检测系统 - 蛋白抽提

说明书:

AR0106

300元/Kit  

WB

WB辅助试剂

现货

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Product Brief

  • 产品概况

    产品货号AR0106
    产品名称亚细胞结构胞核与胞浆蛋白抽提试剂盒(60次)
    价格规格¥300/Kit
    主要成分

    胞浆蛋白提取试剂A     30ml

    胞浆蛋白提取试剂B     1.5ml

    胞核蛋白提取试剂       15ml

    保存条件4℃保存,一年有效。
    产品说明

    对于湿体积为50μl的细胞抽提样品,本品可以抽提60次,对于0.1g的组织抽提样品,本产品可以抽提30次。

    博士德细胞胞浆和胞核蛋白提取试剂盒提供了一种简单、方便的从哺乳动物培养细胞或新鲜的哺乳动物组织中抽提胞浆蛋白和胞核蛋白的方法。抽提得到的蛋白为非变性型,有活性,可以用于后续操作。本试剂盒是通过在低渗透压条件下,使细胞充分膨胀后破坏细胞膜,释放出细胞浆蛋白,然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。

    产品特点:

    1.兼容性好,获得的样本适合于多种下游应用,包括免疫印迹、凝胶迁移分析、蛋白分析、报告基因分析以及酶活性分析。

    2. 可在90分钟内完成蛋白的提取。

    3. 操作简单,无需超速梯度离心。

    4. 一般情况下,胞浆蛋白与核蛋白之间的交叉污染在10%左右,基因组DNA/mRNA的干扰均降到了最低。

    5.胞核蛋白一旦经过脱盐或稀释,即可用于免疫分析和蛋白相互作用实验,如迁移率分析(EMSA)、免疫共沉淀(Co-IP)和pull-down实验。

    6.本方法分离得到的主要是细胞核中的可溶蛋白,而非与染色质结合的蛋白或核膜整联蛋白。


Instructions

注意事项:

1.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

2.对于组织样品,本试剂盒比较适合于新鲜组织,对冻存过的组织抽提效果不是很理想。

3.建议使用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度。

4.如果需要更浓缩的核提取物,提取中使用的胞核蛋白提取试剂的体积可以降低2到4倍,而不会对蛋白质回收产生不利影响。

5.如果在随后的应用中需要大量的核提取物,或者如果下游实验出现问题,请在使用前透析核提取物以去除多余的盐。

6.使用蛋白酶抑制剂来保持提取物的完整性和功能。

需要材料:

蛋白酶或磷酸酶抑制剂

2ml的离心管

涡旋仪

达到16000g的离心机

PBS: 0.1M 磷酸钠, 0.15M NaCl,pH 7.2

使用方法:

溶液准备:取出胞浆蛋白提取试剂和胞核蛋白提取试剂置于冰上,使用前根据需要加入酶抑制剂。

细胞样品:

1.  对于贴壁细胞:细胞刮刮下细胞,600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,留下细胞沉淀备用。

2.  对于悬浮细胞:600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,留下细胞沉淀备用。

3.加入适量的预冷的PBS重悬细胞, 600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,留下细胞沉淀备用。

4.按照下表加入各试剂的量

细胞湿体积(μl)

胞浆蛋白提取试剂A(μl)

胞浆蛋白提取试剂B(μl)

胞核蛋白提取试剂(μl)

10

100

5

50

20

200

10

100

50

500

25.5

250

100

1000

50

500

5. 加入胞浆蛋白提取试剂A,振荡混匀数秒,使细胞完全悬浮并分散开,放置在冰上孵育10分钟。

6. 加入胞浆蛋白提取试剂B,振荡混匀5 秒,冰上孵育1分钟。

7.振荡混匀5秒,16000g 离心5分钟。

8.立即吸取上清至一预冷的离心管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白,上清至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存,用于后续的分析。

9.加入胞核蛋白提取试剂,振荡混匀数秒,使沉淀完全悬浮并分散开,放回冰浴中孵育40分钟,期间每隔10分钟拿出来振荡混匀15秒, 16000g 离心5分钟。

10.立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞核蛋白,将分离的胞核蛋白溶液至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存,用于后续的分析。

组织样品:

1.手术切除组织块,迅速置于预冷的PBS中,漂洗数次,滤纸吸干水分,将组织切成细小的组织块,称重取组织,按照下表加入各试剂的量

组织重量(mg)

胞浆蛋白提取试剂A(μl)

胞浆蛋白提取试剂B(μl)

胞核蛋白提取试剂(μl)

20

200

10

100

40

400

20

200

80

800

40

400

100

1000

50

500

2.加入胞浆蛋白提取试剂A,在匀浆器中匀浆,在冰上操作,直至获得均匀的悬浮液,匀浆后把匀浆液转移到预冷的塑料离心管内,冰浴放置10分钟。

3. 加入胞浆蛋白提取试剂B,振荡混匀5 秒,冰上孵育1分钟。

4.振荡混匀5秒,16000g 离心5分钟。

5.立即吸取上清至一预冷的离心管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白,上清至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存,用于后续的分析。

6.加入胞核蛋白提取试剂,振荡混匀数秒,使沉淀完全悬浮并分散开,放回冰浴中孵育40分钟,期间每隔10分钟拿出来振荡混匀15秒,16000g 离心5分钟。

7.立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞核蛋白,将分离的胞核蛋白溶液至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存,用于后续的分析。

结果实例1:

6-6.png

采集不同的小鼠组织(100mg),用PBS漂洗后采用本试剂盒进行裂解,使用博士德BCA蛋白质定量试剂盒测定提取物浓度。


结果实例2:

7-7.png                                                                                                                                                         

选用不同的小鼠组织,用本试剂盒提取的蛋白作做免疫印迹实验,上图为GAPDH在胞浆和胞核的表达情况,下图为PCNA在胞浆和胞核的表达情况。

 

疑难解答:

问题

原因

解决方法

提取的胞浆蛋白量少

细胞没裂解完全

增加胞浆蛋白提取试剂的量


细胞没完全分散开

完全混匀细胞


组织没充分匀浆

匀浆充分

提取的核蛋白量少

细胞核沉淀没分散开

完全混匀细胞核沉淀

细胞核量少

增加离心时间

蛋白没有活性或活性低

样品没低温保存

低温处理样品

样品中蛋白酶的存在

加入酶抑制剂

胞浆胞核蛋白交叉

胞浆蛋白裂解时间过长

减少加入胞浆蛋白提取试剂A和B后的孵育时间

胞浆蛋白溶液没有完全吸干净

小心吸干净胞浆蛋白溶液

取上清时吸入少量的胞核沉淀

小心吸干净胞浆蛋白溶液


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